BUNSEN本生帶您解讀：PCR實(shí)驗(yàn)耗材

　　什么是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)?

　　聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是一項(xiàng)用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它是在DNA聚合酶和核苷酸底物共同參與下，將該段DNA擴(kuò)增至足夠數(shù)量，以便進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析。

　　影響PCR實(shí)驗(yàn)的因素之一——耗材

　　在PCR實(shí)驗(yàn)中，影響擴(kuò)增效果的因素有很多。我們能想到的有dNTP的質(zhì)量與濃度、模板核酸的量與純化程度、引物的設(shè)計(jì)、DNA聚合酶的濃度、擴(kuò)增長(zhǎng)度等問(wèn)題。 實(shí)際上，使用的耗材也可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而這往往被我們所忽略。因此在選擇實(shí)驗(yàn)耗材前，我們還需要了解PCR耗材相關(guān)的特性和術(shù)語(yǔ)。

　　如何選擇合適的PCR耗材?

　　1、原材料

　　PCR/qPCR耗材一般都是聚丙烯(PP)材質(zhì)。

　　因其為生物學(xué)惰性材料，表面不易粘附生物分子，且有著良好的化學(xué)耐性，及溫度耐受性 (可121℃高壓滅菌，也可以承受熱循環(huán)過(guò)程中的溫度變化)。這些材料通常會(huì)與試劑或者樣品直接接觸，因而在生產(chǎn)制備過(guò)程中需要選用高質(zhì)量的材料和良好的加工工藝。

　　2、選擇合適的容積

　　PCR管的體積規(guī)格大多數(shù)都可以滿足PCR反應(yīng)要求。但是在滿足實(shí)驗(yàn)要求的基礎(chǔ)上，優(yōu)先推薦選用低容管。因?yàn)榈腿莘磻?yīng)管/板有著較小的上方空間，可提高熱傳導(dǎo)率并降低蒸發(fā)。而且在加樣時(shí)，需要避免加樣過(guò)量或過(guò)少。過(guò)量會(huì)導(dǎo)致熱傳導(dǎo)率下降，溢出及交叉污染，而加樣過(guò)少可能會(huì)造成樣品蒸發(fā)損失。

　　3、本生PCR管管蓋的選擇

　　平蓋與凸蓋各有優(yōu)勢(shì)：

　　平蓋可為qPCR提供精確的熒光信號(hào)傳遞;便于書寫標(biāo)記;合蓋容易，密封性好，易于操作。

　　凸蓋與PCR儀熱蓋接觸，減少壓力引起的反應(yīng)管變形，更好的防止液體蒸發(fā)。但會(huì)影響熒光信號(hào)傳遞，無(wú)法應(yīng)用于qPCR實(shí)驗(yàn)。

　　4、96孔板裙邊的選擇

　　無(wú)裙邊板：可適用于大多數(shù)的PCR儀或qPCR儀，但不適用于自動(dòng)化、應(yīng)用。移液過(guò)程中穩(wěn)定性不高，需要配合板托使用。

　　半裙邊板：可適配標(biāo)簽或應(yīng)用條碼，適合自動(dòng)化應(yīng)用，且有著較好的移液穩(wěn)定性。

　　本生全裙邊板：非常適用于自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，也可適配標(biāo)簽及應(yīng)用條碼。機(jī)械強(qiáng)度較好，可適用于凸出模塊的PCR儀，且移液過(guò)程中穩(wěn)定性高。

　　5、根據(jù)實(shí)驗(yàn)選擇耗材

　　根據(jù)檢測(cè)方法的不同，耗材的選擇也不同。PCR實(shí)驗(yàn)分為普通PCR法和熒光定量PCR法。普通PCR法一般是終點(diǎn)PCR跑膠法測(cè)定，所以所用耗材的導(dǎo)熱性和密封性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著密不可分的關(guān)系;而熒光定量PCR是實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)，除了導(dǎo)熱性和密封性外，對(duì)透光性和避光性也有所要求。

　　熒光定量PCR耗材：

　　導(dǎo)熱性：導(dǎo)熱性越好越均一，PCR的速度就越快，準(zhǔn)確度也越高。

　　密封性：密封性越好，產(chǎn)物的揮發(fā)越少，得到的產(chǎn)物就越多，同時(shí)氣溶膠的產(chǎn)生也越少，對(duì)于下一輪實(shí)驗(yàn)的污染也就越少，也就意味著假陽(yáng)性的產(chǎn)生率越低。

　　避光性：這是針對(duì)熒光定量而言的，如果我們?cè)谡麄€(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)注意避光，帶有熒光的試劑過(guò)度被消耗，那直接就會(huì)影響我們實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增效率，導(dǎo)致產(chǎn)生不準(zhǔn)確的結(jié)果。

　　透光性：這也是對(duì)于熒光定量而言，我們知道它是一種實(shí)時(shí)定量的方式，那么耗材本身的透光性就直接關(guān)系到我們檢測(cè)到的熒光信號(hào)多少。如果選擇耗材透光性良好，需要檢測(cè)到的信號(hào)就會(huì)變得微弱，那就會(huì)造成我們對(duì)結(jié)果的誤判。所以對(duì)于熒光定量而言，白色PCR板效果優(yōu)于透明PCR板。

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